اندازه ­گیری مقدار سلولز بر اساس روش اسید نیتریک صورت گرفت. بدین صورت که ابتدا معادل ۲ گرم پودر خشک که طبق دستورالعمل استاندارد T264 cm-97 استاندارد TAPPI]۶۵[ باید عاری از مواد استخراجی باشد را داخل بالن ۲۵۰ میلی­لیتری ریخته و مخلوط ۱۰۰ میلی­لیتر الکل اتیلیک ۹۶% و ۵۰ میلی­لیتر اسید نیتریک ۶۵% به آن افزوده شد. بالن روی اجاق برقی قرار گرفت. پس از ۱ ساعت جوشیدن ملایم، محتویات بالن از کاغذ صافی عبورداده شد و مجدداً مواد روی کاغذ صافی به داخل بالن برگردانده شد و با افزودن اتانول و اسید نیتریک تازه، عملیات فوق دو بار دیگر تکرار گردید. پس از تکرار سوم، مواد باقی­مانده روی صافی به عنوان سلولز در آون در دمای ۱۰۵ درجه سانتی ­گراد قرار داده شد تا خشک شود. سپس به دسیکاتور انتقال یافت و بعد از آن توزین گشت (شکل۳-۱۱). درصد سلولز از معادله ۳-۶ محاسبه شد:
)۳-۶) (وزن اولیه پودر خشک/ وزن سلولز خشک) × ۱۰۰₌ درصد سلولز
شکل ۳-۱۱: سلولز استخراج شده از نمونه
۳-۱۶-تعیین درصد لیگنین
اندازه ­گیری بر طبق آئین­نامه T222 om-02 استاندارد TAPPI صورت گرفت ]۶۶[. بدین منظور مقدار ۲ گرم پودر خشک عاری از مواد استخراجی، داخل بشر ۵۰ میلی­لیتری ریخته شده و مقدار ۱۵ میلی­لیتر اسید سولفوریک ۷۲% به آن افزوده شد. بشر محتوی پودر و اسید به مدت دو ساعت در دمای اتاق قرار گرفت. طی این مدت، محتویات بشر به دفعات با میله شیشه ­ای بهم زده شد. بعد از این مدت، مخلوط اسید و پودر همراه با ۵۶۰ میلی­لیتر آب مقطر داغ به داخل بالن ۱۰۰۰ میلی­لیتری منتقل گردید (بدین ترتیب حجم کل محتویات داخل بالن به ۵۷۵ میلی­لیتر رسید و غلظت اسید سولفوریک به ۳% کاهش یافت). سپس سیستم روی اجاق برقی قرار گرفت. محتویات داخل بالن پس از ۴ ساعت جوشیدن، صاف شده و کاغذ صافی به همراه محتویاتش (لیگنین) داخل آون با دمای ۱۰۵ درجه سانتی ­گراد به مدت ۳ ساعت قرار داده شد. پس از آن، کاغذ صافی داخل دسیکاتور قرار گرفته و سپس توزین شد (شکل ۳-۱۲). درصد لیگنین با معادله ۳-۷ محاسبه شد:
(۳-۷) (وزن اولیه پودر خشک/ وزن لیگنین خشک) ×۱۰۰₌ درصد لیگنین
۳-۱۲: لیگنین استخراج شده از نمونه
۳-۱۷- تعیین درصد همی­سلولز
مقدار درصد همی سلولز بوسیله کم کردن درصد مقدار مواد استخراجی، مقدار سلولز و مقدار لیگنین از ۱۰۰ مطابق معادله ۳-۸ محاسبه گردید:
درصد همی­سلولز₌۱۰۰- (۳-۸) (لیگنین + مواد استخراجی + سلولز)
۳-۱۸- محاسبه میزان پروتئین به روش برد فورد^[۷۰]
غلظت پروتئین با بهره گرفتن از روش برد فورد اندازه گیری شد. روش برد فورد یکی از دقیق ترین روش های اندازه گیری میزان پروتئین می باشد و بسیار سریع است. از این روش برای مقاصد مختلفی استفاده می شود بخصوص در پزشکی برای اندازه گیری پروتئین بخش های مختلف سلولی و بدست آوردن غلظت پروتئین در الکتروفورز ژلی مورد استفاده قرار می گیرد. از مزایای این روش می توان به ارزان و سریع بودن و بسیار حساس بودن آن اشاره کرد. علاوه بر این، این روش سازگار با طیف وسیعی از مواد بوده و برای پروتئین های مختلف پاسخگو است. انتخاب استاندارد در روش برد فورد بسیار حائز اهمیت است. این روش بر مبنای توانایی پیوند رنگ کوماسی با pH اسیدی کار می کند. به این ترتیب که رنگ کوماسی با گروه های قابل یونیزه شدن پروتئین واکنش داده و باعث تغییر شکل در ساختمان پروتئین می شود که در نتیجه آن گروه های آب گریز پروتئین در سطح قرار گرفته و شرایط را برای پیوند غیراختصاصی و برگشت ناپذیرکوماسی به پروتئین مهیا می کنند. پیوند پروتئین به رنگ کوماسی فرم آبی رنگ را تثبیت می کند و منجر به تغییر رنگی متناسب با میزان پروتئین می شود. این روش بر مبنای جذب است که در آن بیش ترین جذب محلول اسیدی کوماسی بلو بعد از پیوند با پروتئین از ۴۶۵ نانومتر به ۵۹۵ نانومتر تغییر می یابد ]۶۸,۶۷[.

۳-۱۸-۱- تهیه معرف بردفورد
برای تهیه معرف برد فورد مقدار۱۰۰ میلی گرم پودرکوماسی بریلیانت بلو^[۷۱](G-250) را در۵۰ میلی لیتر اتانول ۹۵% حل کرده محلولی زنگاری رنگ حاصل می شود. سپس بر روی شیکر مقدار۱۰۰ میلی لیتر محلول اسید فسفریک ۸۵% به صورت قطره قطره به محلول فوق اضافه شد. در این حالت رنگ محلول به تدریج تغییر نموده و نهایتاً قهوه ای روشن شد و در نهایت حجم محلول به ۱ لیتر رسانده شد (شکل ۳-۱۳). غلظت نهایی این محلول حاوی (w/v) ۰۱/۰% کوماسی بلو، (w/v) ۷/۴% اتانول و (w/v) ۵/۸% فسفریک اسید است ]۶۹[.

شکل ۳-۱۳: پودر کوماسی بلو و محلول معرف برد فورد تهیه شده در آزمایشگاه
۳-۱۸-۲- تهیه منحنی استاندارد پروتئین
به منظور تهیه منحنی استاندارد پروتئین از بوین سرم آلبومین^[۷۲] استفاده شد. محلول ۲ گرم بر لیتر آن آماده شد و با بهره گرفتن از جدول ۳-۴ غلظت های مختلف برای ترسیم منحنی استاندارد تهیه شد.
جدول ۳-۴: غلظت های مورد نیاز برای ترسیم منحنی استاندارد پروتئین