۱/۰ ۰۵/۱
I
۶/۰ ۶/۱
II
۲/۱/۰ ۳/۳
III
(۴۹ درصد) ۳/۲ ۴/۶ و (۵۱ درصد) ۸/۱ ۹/۵
IV
(۶/۷۵ درصد) ۳/۱ ۱/۹ و (۴/۲۴ درصد) ۸/۱ ۳/۱۳
V
بررسی داده ها با نرم افزار Brookhaven صورت گرفت. I)نمونه ی تازه تهیه شده انسولین، II) نمونه ی انسولین انکوبه شده در غیاب آسپیرین به مدت ۲۰روز، III) نمونه ی انسولین انکوبه شده در غیاب آسپیرین به مدت ۳۶روز، IV) نمونه ی انسولین انکوبه شده با آسپیرین به مدت ۲۰روز، V) نمونه ی انسولین انکوبه شده با آسپیرین به مدت ۳۶روز.
۴-۵- مطالعه ساختار دوم پروتئین انسولین استیله به روش دو رنگ نمای دورانی
روش دو رنگ نمای دورانی (CD) برای بررسی تاثیر استیلاسیون به وسیله ی آسپیرین بر ساختار دوم پروتئین انسولین بعد از انکوباسیون به مدت ۲۰ و ۳۶ روز استفاده شد. بررسی ساختار پروتئین به وسیله ی روش دو رنگ نمای دورانی در دو محدوده ی ناحیه ی فرابنفش دور (بررسی ساختار دوم) و ناحیه ی فرابنفش نزدیک (بررسی ساختار سوم) صورت می گیرد. طیف دو رنگ نمای دورانی انسولین دارای دو کمینه در طول موج های ۲۰۸ و ۲۲۲ نانومتر است. این کمینه ها نشان می دهد که این پروتئین غنی از ساختارهای مارپیچ آلفا می باشد. مشخص شده است که محتوای ساختار دوم پروتئین های آمیلوئیدوژنیک نقش مهمی در ویژگی های آمیلوئیدی آن ها دارد (Ecroyd و همکاران ۲۰۰۹). فیبر های انسولین تجمعات غنی از صفحات بتا هستند در حالی که انسولین طبیعی غنی از ساختار های مارپیچ آلفا می باشد. بنابراین ضمن فرایند فیبریلاسیون، انسولین دچار تغییرات ساختاری می شود که طی آن ساختارهای مارپیچ آلفا به صفحات بتا تبدیل می گردد. توالی های LVEALYL، LYQLEN، VEALYL در پروتئین انسولین مسئول شروع تجمعات انسولینی می باشند و نقش اساسی در ایجاد ساختارهای فیبری این پروتئین دارند (Nielsen و همکاران ۲۰۰۱، Brange و همکاران ۱۹۹۷).
در شکل ۴-۵ مشاهده می شود که میزان مارپیچ آلفا (کمینه ها در طول موج های ۲۰۸ و ۲۲۲ نانومتر) در نمونه های انسولین استیله شده با آسپیرین برای ۲۰ و ۳۶ روز در مقایسه با نمونه های کنترل کاهش یافته است. کاهش ساختار های مارپیچ آلفا برای نمونه ی استیله برای ۳۶ روز نسبت به همتای آن در مدت زمان ۲۰ روز به مراتب چشمگیرتر است. از این رو می توان ادعا کرد که انسولین استیله در مدت زمان ۳۶ روز غنی از صفحات بتا شده است.
شکل ۴-۵- طیف دو رنگ نمای دورانی محدوده فرابنفش دور نمونه های انسولین استیله شده در مدت زمان ۲۰ روز (A) و ۳۶ روز (B).
برای این مطالعه غلظت ۲/۰ میلی گرم در میلی لیتر انسولین به کار برده شد. اندازه گیری دو رنگ نمای دورانی در بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار با ۴/۷pH و در دمای ۲۷ درجه سانتی گراد انجام گرفت. حروف F، N و Ac به ترتیب معرف طیف دو رنگ نمای دورانی نمونه های انسولین تازه تهیه شده، انسولین انکوبه در عدم حضور آسپیرین و انسولین انکوبه شده در حضور آسپیرین می باشد.
آنالیز داده های این مطالعه با نرم افزار CDNN نشان می دهد که تبدیل ساختارهای مارپیچ آلفا به صفحات بتا در نمونه های انسولین استیله و غیر استیله در مقایسه با انسولین تازه تهیه شده رخ داده است (جدول ۴-۲). همچنین میزان تغییرات ساختاری نمونه های کنترل نسبت به نمونه های استیله به مراتب کمتر می باشد. تمایل توده ای شدن و تشکیل فیبر آمیلوئیدی انسولین استیله شده با آسپیرین برای ۳۶ روز را می توان با افزایش قابل توجه محتوای ساختارهای بتا در این نمونه توجیه کرد. به طور کلی می توان گفت که فرایند استیلاسیون پروتئین انسولین به افزایش محتوای صفحات بتای این پروتئین می انجامد که این پدیده تاثیر قابل ملاحظه ای نیز بر فرایند توده ای شدن این پروتئین خواهد داشت.
جدول ۴-۲- محتوای ساختارهای دوم نمونه های مختلف انسولین بر حسب درصد.
نمونه
مارپیچ آلفا
صفحات بتا
پیچه های بتا
پیچه های نامنظم
I
۳/۴۴
۲/۱۶
۹/۱۲
۵/۲۶
II
۶/۳۰
