Abs مقدار جذب در افزایش زمان (t) برحسب دقیقه
tزمان بر حسب دقیقه
فعالیت ضداکسایشی به صورت –Abs^-3 / min / mg وزن تر میوه گزارش شد.
۲-۱۱- آنالیز آماری
برای همه آزمایش‌های انجام شده سه تکرار در نظر گرفته شد. نتایج به صورت مقادیر میانگین و خطای استاندارد (SE) بیان شدند. داده‌های بیوشیمیایی در طرح قالب فاکتوریل، با طرح پایه کاملاً تصادفی، با بهره گرفتن از آنالیز واریانس دوسویه و نرم افزار SPSS تجزیه شدند. این آزمایش‌ها با بهره گرفتن از آزمون TUKEY در سطح آماری ۵ درصد (۰۵/۰ < P) آنالیز ومعنی دار گردیدند.

فصل سوم
نتایج و بحث
۳- فصل سوم: نتایج و بحث
۳-۱- انتخاب حلال مناسب
عصاره‌گیری گیاهان به وسیله حلال‌های مختلف صورت می‌گیرد. مهمترین و اساسی‌ترین عاملی که باید مورد توجه قرار گیرد، حلال مناسب است که انتخاب آن به قسمت‌های مختلف گیاه و نیز مواد تشکیل دهنده آن بستگی دارد. روش‌های مختلفی جهت عصاره‌گیری و استخراج ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی از اندام‌های گیاهی وجود دارد که می‌توان از حلال‌های مختلف نظیر آب، متانول، اتانول و… استفاده کرد. عصاره‌های الکلی در مقایسه با عصاره‌های آبی، در حد قابل توجهی مقدار ترکیب‌های فنلی بیشتری استخراج می‌کنند (Marcocci et al., ۱۹۹۴). در مطالعه حاضر از دو حلال اتانول و متانول جهت عصاره‌گیری و استخراج ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی استفاده شد.
۳-۲ نتایج حاصل از سنجش میزان کل ترکیبات فنلی در عصاره‌های مختلف انگور
نمودار (۳-۱) محتوای فنل کل عصاره‌های اتانولی و متانولی بخش‌های مختلف (برگ، غوره، انگور و کشمش) انگور رقم کشمشی قرمز را نشان می‌دهد. نتایج بررسی‌های آماری نشان دادند که نوع حلال (صرف نظر از نوع اندام گیاهی) اثر معنی داری بر میزان استخراج ترکیبات فنلی دارد. بین عصاره‌های اتانولی و متانولی اندام‌ها اختلاف معنی داری مشاهده شد اما به طور کلی ترکیبات فنلی توسط حلال اتانولی در همه اندام‌ها به استثناء برگ‌ها بیشتر استخراج شدند. در عصاره اتانولی ما بین برگ‌ و غوره اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد اما بین برگ با انگور و کشمش اختلاف معنی‌داری مشاهده شد. در عصاره متانولی بین همه اندام‌ها اختلاف معنی‌داری مشاهده شد که بیشترین محتوای فنلی در برگ و کمترین محتوای فنلی در میوه رسیده مشاهده شد. در حلال اتانولی بیشترین محتوای فنلی در کشمش و کمترین میزان آن در میوه رسیده مشاهده شد. غوره و برگ، میزان محتوای فنل حدواسطی را نشان دادند. عصاره اتانولی کشمش بیشترین میزان ترکیبات فنلی و عصاره متانولی انگور کمترین میزان ترکیبات فنلی را نشان دادند.

نمودار ۳-۱- محتوای فنولی (بر حسب میلی گرم گالیک اسید در یک گرم وزن تر) بخش‌های مختلف (برگ، غوره، انگور و کشمش) انگور رقم کشمشی قرمز در عصاره‌های اتانولی و متانولی (۳ تکرار SE، ۰۵/ ۰(P<.
ترکیبات فنلی به عنوان پاداکساینده‌های آب دوست شناخته شده‌اند و به صورت یک پاسخ در گیاهان صدمه دیده بر علیه بیماری‌زاها تولید می‌شوند. آن‌ها اساساً خصوصیات پاداکسایشی، ضد جهش، ضد تومور، ضد خرابی بافت‌ها و ضد سرطان از خود نشان می‌دهند (Lee et al., 2003).
مشخص شده است که ترکیبات فنلی به کیفیت و ارزش غذایی کمک می‌کنند و رنگ، مزه، عطر و طعم را بهبود می‌بخشند و همچنین موجب اثرات سلامتی بخش می‌شوند. آن‌ها همچنین باعث ایجاد سازوکار دفاعی در گیاهان برای خنثی کردن گونه‌های واکنش‌گر اکسیژن به منظور سالم نگه داشتن و جلوگیری از آسیب مولکولی و آسیب به وسیله‌ی میکروارگانیسم‌ها، حشرات و علف خوارها می‌شوند (Vaya et al., ۱۹۹۷).
شمار وسیعی از گیاهان به عنوان منبع پایدار پاداکساینده‌های طبیعی شامل توکوفرول ها، ویتامین‌ها، کاروتنوئیدها و ترکیبات فنولی هستند که برای نگهداری سلامتی و حفاظت از بیماری کرونری قلب و سرطان مسئول هستند (Castenmiller et al., ۲۰۰۲).
Bang وهمکاران (۱۹۹۹) نشان داده‌اند که استفاده از حلال متانولی برای عصاره‌گیری، محتوای فنلی بیشتری را در مقایسه با حلال‌های آبی نشان می‌دهد و حتی میزان غلظت متانول استفاده شده هم می‌تواند در میزان استخراج ترکیبات گیاهی تاثیر گذار باشد. یعنی با افزایش غلظت متانول میزان فنل استخراجی بیشتر می‌شود. تحقیقی در سال ۲۰۰۹ توسط Orhan و همکاران بر روی فعالیت‌های بیولوژیکی برگ انگور (Vitis vinifera L.) انجام گرفته است و محتوای فنولی برگ در حلال‌های مختلف مورد بررسی قرار گرفته که در جز^[۹]EtoAc بیشتر بود (Orhan et al., ۲۰۰۹). مطالعه‌ای توسط Baydar و همکاران (۲۰۰۴) بر روی محتوای فنلی و فعالیت ضد باکتریایی عصاره‌ی انگور انجام گرفته است که نشان می‌دهد محتوای فنلی در حلال‌های مختلف متفاوت است و محتوای فنلی عصاره دانه بیشتر از تفاله می‌باشد. نتایج بررسی مطالعه حاضر نیز با گزارشات فوق مطابق است و هر دو عصاره، محتوای فنلی متفاوت را نشان دادند.
در پژوهشی در یونان، فعالیت آنتی اکسیدانی، فنول، آنتوسیانین‌ها و فعالیت پلی فنول اکسیداز در ۱۶ رقم انگور قرمز رنگ و همبستگی آن‌ها بررسی شد ومشخص گردید که همبستگی بالایی بین فعالیت آنتی اکسیدانی و مقدار فنول نسبت به فعالیت آنتی اکسیدانی و مقدار آنتوسیانین وجود داشت (Hunt and Baker, 1980).
در مطالعه‌ای دیگر که در سال ۲۰۱۰ جهت تعیین ترکیبات پلی فنلی، خصوصیات پاداکسایشی و ضد باکتریایی عصاره‌ی پوست میوه‌ی ۱۴ رقم انگور که ۷ رقم سفید و ۷ رقم قرمز بود صورت گرفته است، مشاهده شده است که در مجموع مقدار فنول کل موجود در پوست میوه ارقام قرمز بیشتر از سفید می‌باشد (Katalinic et al., ۲۰۱۰).
در سال ۲۰۰۷ مطالعه ای توسط Chiou و همکاران بر روی محتوای فنلی و فعالیت پاداکسایشی کشمش سه زیر رقم انگور که هر کدام از سه منطقه مختلف یونان جمع آوری شده بود صورت گرفته است. مقدار فنول کل بین زیر ارقام مختلف و مناطق انتخاب شده زیر ارقام مختلف و مناطق مختلف متفاوت بود و با مقادیر فنول بدست آمده از پوست انگور تازه مشابه بود.
Andarwulan و همکاران (۲۰۱۰) ترکیبات فنولی و انواع فلاونوئیدها را در سبزیجات اندونزی شناسایی کرده اند. علاوه بر این توجه دانشمندان به جایگزین کردن پاداکساینده‌های طبیعی در پس مانده‌های صنایع زراعتی نیز جلب شده است. پاداکساینده‌های طبیعی زیادی با عملکردهای گوناگون شناخته شده است اما پلی فنول‌ها با داشتن توانایی جاروب کنندگی رادیکال‌های آزاد بیشتر مورد توجه قرار گرفته اند. ترکیبات فنولیک در تعیین کیفیت میوه نقش مهمی دارند و چون این ترکیبات روی ویژگی‌هایی مانند عطر، طعم و تلخی میوه نقش دارند، مقدار و فعالیت آن‌ها در میوه‌های انگور بسیار مورد توجه است (Benevenuti et al., 2004).
۳-۳ نتایج حاصل از سنجش میزان کل فلاونوئیدها در عصاره‌های مختلف انگور
نمودار ۳-۲ محتوای فلاونوئید کل عصاره‌های اتانولی و متانولی بخش‌های مختلف (برگ، غوره، انگور و کشمش) انگور رقم کشمشی قرمز را نشان می‌دهد. با توجه به آنالیز آماری، نوع حلال استفاده شده تاثیر معنی‌داری بر میزان ترکیبات فلاونوئیدی استخراج شده از اندام‌های مختلف داشت. در مقایسه دو حلال اختلاف موجود طبق آنالیز واریانس انجام گرفته در میزان محتوای فلاونوئیدی معنی‌دار است. ترکیبات فلاونوئیدی توسط حلال متانول بیشتر استخراج شدند، تنها استثنا در این مورد برگ‌ها هستند که بر خلاف اندام‌های دیگر مورد آزمایش حلال اتانولی نسبت به متانول بهتر عمل نموده است. در عصاره‌های متانولی، در میزان فلاونوئیدها اندام‌های برگ، غوره، انگور و کشمش اختلاف معنی‌داری مشاهده شد. در عصاره‌های اتانولی به استثنا برگ اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد. عصاره متانولی کشمش بیشترین و عصاره متانولی برگ کمترین میزان ترکیبات فلاونوئیدی را نشان دادند.
فلاونوئیدها ترکیبات زیستی فعال مهمی هستند که توانایی کاهش تشکیل و پاکسازی رادیکال‌های آزاد را دارند. آن‌ها در گیاهان به عنوان ترکیبات پاداکساینده، ضد میکروب، گیرنده نور و غربال کننده نور عمل می‌کنند (Iwashina, 2003).
فلاونوئیدها محصولات سازوکار ثانویه در گیاهان هستند. آن‌ها به دلیل فعالیت‌های پاداکسایشی که دارند در داروسازی و صنایع غذایی مورد توجه قرار گرفته‌اند (Paniwnyk et al., ۲۰۰۱).
میزان خاصیت پاداکسایشی ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی به شدت به ساختمان شیمیایی آن‌ها و بیش از همه به گروه‌های هیدروکسیل موجود در ساختارشان بستگی دارد. مهم‌ترین عامل پاداکسایشی در فلاونوئیدها وجود گروه کتکول در (دی هیدروکسی) در حلقه B است (Salah et al., ۱۹۹۵).
نمودار ۳-۲: محتوای فلاونوئید کل (برحسب میلی گرم کاتچین بر گرم وزن تر) بخش‌های مختلف (برگ، غوره، انگور و کشمش) انگور رقم کشمشی قرمز در عصاره‌های اتانولی ومتانولی (۳ تکرار SE، ۰۵/۰(P<.
در انگورهای قرمز، آنتوسیانین‌ها و فلاونوئیدها دو گروه مهم از ترکیبات فنولی بوده و کاتچین بیشترین فلاونوئید می‌باشد (Prior et al., 1998). طی مطالعه‌ای که توسط Bozin و همکاران در سال ۲۰۰۸ بر روی ترکیبات فنولی گل، ساقه و برگ سیر صورت گرفته است، فلاونوئید کل موجود در گیاهان سیر نابالغ بیشتر از بالغ گزارش شده است (Bozin et al., ۲۰۰۸). نتایج بررسی حاضر نیز با گزارش فوق مطابق است و میوه نارس بیشترین میزان فلاونوئید کل را نسبت به میوه رسیده نشان داد.
در تحقیقی که در سال ۲۰۱۰ توسط Katalinic و همکاران انجام شد، محتوای فلاونوئید کل عصاره‌ی پوست میوه‌ی ۱۴ رقم انگور سفید و قرمز (۷ رقم سفید و ۷ رقم قرمز) مورد بررسی قرار گرفت که میزان میانگین فلاونوئید کل در ارقام قرمز بیشتر از سفید گزارش شد.
طی تحقیقی در سال ۲۰۰۸ فعالیت‌های پاداکسایشی پوست ذرت ایرانی توسط Ebrahimzadeh و همکاران مورد مطالعه قرار گرفته است. محتوای فلاونوئید کل پوست ذرت اندازه گیری شد. بر اساس این تحقیق حضور این ترکیبات فیتوشیمیایی در عصاره پوست ذرت می‌تواند فعالیت‌های پاداکسایشی آن را توضیح دهد.
در تحقیقاتی که در سال ۲۰۱۱ توسط Chen و همکاران انجام شد، محتوای فلاونوئید میوه مرکبات به صورت تازه و بعد از تیمار خشکی در دماهای مختلف مورد بررسی قرار گرفت. بعد از تیمار در دماهای ۵۰ تا ۶۰ درجه‌ی سانتی‌گراد مقدار فلاونوئید کاهش یافت و بعد از تیمار در دماهای ۷۰ تا ۱۰۰ درجه‌ی سانتی‌گراد مقدار فلاونوئید افزایش پیدا کرد.
۳-۴ نتایج حاصل از آزمون DPPH در عصاره‌های مختلف انگور
دی فنیل پیکریل هیدرازیل (DPPH) رادیکال پایداری است که در واکنش‌های اکسیداسیون و احیاء به عنوان یک ماده اکسید کننده عمل می کند. این معرف در حالت اکسید شده به رنگ بنفش و در حالت احیا شده زرد رنگ می‌باشد. طبق واکنش مذکور موادی که دارای قدرت احیا کنندگی بالاتر از DPPH باشند از قبیل برخی مواد پاد اکساینده می‌توانند آن‌را احیا نموده و باعث تغییر رنگ آن از بنفش به زرد گردند.
نمودار ۳-۴ نشان دهنده فعالیت جاروب کنندگی رادیکال DPPH در عصاره‌های مورد سنجش است. به‌طوریکه بیشترین درصد جاروب کنندگی مربوط به عصاره اتانولی برگ و کمترین درصد مربوط به عصاره متانولی غوره بود. بین انگور و کشمش اختلاف معنی داری مشاهده نشد.
نمودار ۳-۳: درصد ظرفیت جاروب کنندگی رادیکال‌های آزاد DPPH بخش‌های مختلف (برگ، غوره، انگور وکشمش) انگور کشمشی قرمز در عصاره‌های اتانولی و متانولی (۳ تکرار SE، ۰۵/۰ P < ).
آزمون جاروب کنندگی رادیکال DPPH به طور معمول برای مشخص کردن توانایی پاداکساینده‌ها برای پاکسازی رادیکال‌های آزاد به کار می‌رود (Naczk et al., ۲۰۰۳). در تمامی عصاره‌های مورد سنجش در این مطالعه، تغییر رنگ بنفش به زرد خنثی مشاهده شد که نشان دهنده توانایی عصاره‌های اتانولی و متانولی در اهدا الکترون و یا هیدروژن به رادیکال DPPH است. در سنجش جمع آوری رادیکال DPPH باید توجه داشت که علاوه بر محتوای فنلی، ساختار این ترکیبات نیز از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است بطوریکه گروه کربوکسیل تاثیر منفی روی جمع آوری رادیکال DPPH دارد در حالیکه حضور گروه هیدروکسیل در ساختار آنها این فعالیت را افزایش می‌دهد (Sun, 1990).
رادیکال DPPH یک رادیکال آزاد، پایدار، آلی و نیتروژن‌داری است که به طور وسیعی برای آزمایش پاک کردن رادیکال‌های آزاد مورد استفاده قرار می‌گیرد (Shimoji et al., 2005).
روش جاروب کنندگی رادیکال آزاد DPPH ساده ترین راه ارزیابی توانایی پاداکسایندگی یک ترکیب، عصاره یا منبع زیستی دیگر است. این ساده ترین روش است که در آن ترکیب موثر یا عصاره با محلول DPPH مخلوط شده است و بعد از یک دوره خوانده می‌شود. این روش به وسیله‌ی Blois به منظور تعیین فعالیت پاداکسایشی با بهره گرفتن از رادیکال آزاد پایدار DPPH به وجود آمد (Kedar and Singh, 2011).
در مطالعه Yung-shin و همکاران (۲۰۰۹) در تایوان روی قدرت آنتی اکسیدانی عصاره گل شوید (Anethum graveolens) در تست DPPH، مقدار ۵۰٪ مهار رادیکالی برای بخش‌های اتیل استات، اتانول و هگزان بترتیب ۱۵/۲۸، ۸۳/۵۶، ۰۷/۳۹۹ درصد به دست آمده است. این نتایج نیز نشان دهنده قدرت بالای مهار رادیکالی عصاره‌های مورد مطالعه نسبت به اسانس می‌باشد.
طی تحقیقی در سال ۲۰۰۳ فعالیت‌های پاداکسایشی و ضدمیکروبی عصاره دانه انگور توسط Jayaprakasha و همکاران مورد مطالعه قرار گرفت. میزان جاروب کنندگی رادیکال DPPH در حلال استون، آب و اسید استیک بیشتر از متانول، آب و اسیداستیک گزارش شد.
محتوای فنلی و فعالیت پاداکسایشی ۱۱ رقم انگور در سال ۲۰۰۸ در ترکیه برررسی گردیده است. رقم‌ها، با محتوای فنلی مختلف فعالیت جاروب کنندگی متفاوتی نشان داده‌اند (Bozan et al.,2008).
در تحقیقی در سال ۲۰۱۱ فعالیت‌های پاداکسایشی و ترکیبات فنولی عصاره‌های دانه و پوست میوه انگور قرمز (Vitis vinifera, Vitis labrusca) در برزیل توسط Rockenbach و همکاران بررسی شد. بیشترین فعالیت پاداکسایشی بر اساس آزمون DPPH برای عصاره‌های دانه‌های رقم Pinot noir و عصاره پوست Isabel گزارش شد.
Jayaprakasha و همکاران فعالیت به دام اندازی رادیکال‌های آزاد هسته انگور را مورد بررسی قرار دارند و بیان نمودند که عصاره هسته انگور به عنوان یک آنتی اکسیدان اولیه از به وجود آمدن رادیکال‌های آزاد جلوگیری کرده و نیز با رادیکال‌های آزاد واکنش داده و آنها را پایدار می‌کند. Liu وهمکاران (۲۰۱۰) بین دانه‌های گندم با رنگ‌های مختلف از نظر فعالیت پاداکسایشی مقایسه‌ای انجام داده‌اند. نتایج نشان می‌دهد دانه‌های گندمی که رنگ آنها ارغوانی است نسبت به گندم‌های با رنگ زرد، قرمز و سفید میزان فلاونوئید بیشتری دارند و بالاترین میزان جمع‌ آوری رادیکال‌های DPPH و هیدروکسیل را نیز دارا هستند که با نتایج حاصل از این تحقیق حاضر مطابقت ندارد.
۳-۵ نتایج حاصل از سنجش قدرت احیا در عصاره‌های مختلف انگور
آزمون فعالیت آنتی اکسیدانی احیا آهن روشی است که به طور مستقیم آنتی اکسیدان‌ها و یا احیا کننده‌ها را در نمونه‌ها اندازه گیری می‌کند و رابطه خطی با غلظت آنتی اکسیدانی آن‌ها دارد (Prior et al., 2005). در این روش گیاهانی که فعالیت آنتی اکسیدانی احیاء آهن بالایی دارند قادرند به راحتی رادیکال‌های آزاد موجود در بدن را خنثی کنند. نمودار ۳-۴ قدرت احیا کنندگی (جذب در ۵۹۵ نانومتر) عصاره های اتانولی و متانولی انگور کشمشی قرمز را نشان می‌دهد. در بین عصاره‌ها، بیشترین میزان جذب در عصاره اتانولی غوره و کمترین میزان جذب در عصاره متانولی برگ مشاهده گردید. مطابق با این نمودار از نظر قدرت احیا بین بخش‌های مختلف (برگ، غوره، انگور و کشمش) و بین دوحلال اختلاف معنی داری مشاهده شد. از مقایسه حلال‌ها مشخص شد که عصاره اتانولی عملکرد بهتری نسبت به عصاره متانولی داشت.